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Yi Zhao Photonics

如何為您的實(shí)驗選擇最佳濾光片

發(fā)表時(shí)間:2022-08-22 17:06

  濾光片可以成就,也能夠破壞熒光顯微鏡實(shí)驗。它們是每個(gè)熒光顯微鏡設置的關(guān)鍵組成部分,甚至有可能在最新 LED 顯微鏡照明提供的高速、高對比度成像方面取得突破。但是,最佳濾光片的選擇和配置可能困難重重。在本白皮書(shū)中,我們將引導您找到問(wèn)題的答案,幫助您為所需應用選擇出最適合的濾光片。

濾光片

  您將了解:

  如何為您的實(shí)驗選擇最合適的濾光片 ?

  哪些 Pinkel 和 Sedat 配置可實(shí)現高速成像 ?

  使用 LED 照明時(shí)有關(guān)濾光片的五個(gè)重要提示

  在設計熒光顯微鏡實(shí)驗時(shí),為了獲取高質(zhì)量數據,科學(xué)家通常需要同時(shí)考慮光源、濾光片和熒光團的選擇。我們的許多技術(shù)資源都集中在不同光源的特性與優(yōu)勢上,而本白皮書(shū)也將提供有關(guān)“為寬場(chǎng)熒光顯微鏡(widefield fluorescence microscopy)選擇光學(xué)濾光片”的指導。

  了解濾光片

  一個(gè)標準的熒光顯微鏡裝置通常包括三個(gè)裝在熒光激發(fā)塊(filter cube)中的組件——激發(fā)濾光片(excitation filter)、二色鏡( dichroic mirror / beam splitter,也稱(chēng)為二向色濾光片)和發(fā)射光濾光片(emission filter),如下圖 1 所示:

  激發(fā)濾光片——選擇來(lái)自光源的光的波長(cháng)以匹配熒光團的吸收光譜。

  二色鏡——選擇并傳輸樣本發(fā)出的熒光,并透射樣品發(fā)出的較長(cháng)波長(cháng)。

  發(fā)射光濾光片—— 僅選擇與熒光團發(fā)射曲線(xiàn)相對應的波長(cháng),同時(shí)通過(guò)阻擋自發(fā)熒光、來(lái)自房間的雜散光或反射的 LED 光來(lái)增加對比度。

濾光片

  用于 GFP 成像的濾光片和光源。使用 CoolLED pE-100(藍色圖)的 470 nm LED 對 GFP 進(jìn)行單波長(cháng)成像,沿其激發(fā)光譜(淺綠色)激發(fā) GFP。激發(fā)光路穿過(guò)激發(fā)濾光片(紫色),低于 495 nm 的波長(cháng)被分色鏡(紅色)反射到樣品上。該能量被吸收并以熒光的形式釋放,形成 GFP 發(fā)射光譜(深綠色),二色鏡(紅色)將 495 nm 以上的光透射到檢測器。背景噪聲被發(fā)射光路中的發(fā)射光濾光片(黃色)進(jìn)一步去除。

  實(shí)驗室有數以千計的濾光片和二色鏡可供選擇,而這種選擇取決于單個(gè)熒光團和光源。濾光片的適用性主要取決于它阻擋或透射的波長(cháng),圖 2 就是例子之一。它顯示了 GFP 的光譜圖,由 470 nm 的 LED 和優(yōu)化的單波段濾光片組激發(fā)。

  首先,我們可以看到 藍色的LED 光譜與淺綠色 GFP 的吸收光譜重疊,因此光源與熒光團兼容。紅色的二色鏡反射波長(cháng)小于 495 nm 的光,并將激發(fā)光路導向樣品。在發(fā)射光路中,它會(huì )將 495 nm 以上的波長(cháng)傳輸到檢測器。這對于 GFP 而言是理想的,因為峰值吸收和發(fā)射之間發(fā)生了分裂,即 GFP 的相關(guān)激發(fā)波長(cháng)被反射到樣品上,且相關(guān)的發(fā)射波長(cháng)到達了檢測器。

  紫色的激發(fā)光濾光片是專(zhuān)門(mén)用于傳輸 GFP 吸收光譜所需的 LED 的相關(guān)波長(cháng)。請注意伸至 525 nm 的 LED“尾巴”:由于二色鏡無(wú)法提供完美的分光,超過(guò) 495 nm 的某些波長(cháng)會(huì )被反射到樣品上,或反射到發(fā)射路徑中并形成背景。但是,它會(huì )首先被激發(fā)濾光片阻擋,隨后再被 GFP 吸收的能量以深綠色熒光發(fā)射的形式釋放。在這種情況下,黃色的發(fā)射光濾光片會(huì )進(jìn)一步阻擋來(lái)自 GFP 發(fā)射峰值范圍之外的所有光。

  多重熒光:如何通過(guò)濾光片來(lái)進(jìn)行有效配置?

  對單個(gè)熒光團進(jìn)行成像相對簡(jiǎn)單,只需要在顯微鏡中安裝一個(gè)熒光激發(fā)塊。然而,在單個(gè)實(shí)驗中捕獲多個(gè)熒光團則需要額外考慮平衡速度、對比度和預算。

  單波段濾光片——多個(gè)單波段熒光激發(fā)塊(如圖 1 所示)可被安裝于電動(dòng)顯微鏡濾光片轉輪(motorised microscope filter cube turret)中,以實(shí)現高對比度成像,因為每個(gè)激發(fā)塊都包含特定于各個(gè)熒光團的濾光片組。然而,激發(fā)塊之間的切換速度很慢,將多標記樣本的動(dòng)態(tài)觀(guān)察速度限制在秒級。

  多波段濾光片——為了實(shí)現多個(gè)熒光團的同時(shí)成像,多波段濾光片選擇性地傳輸/阻擋多個(gè)波長(cháng)。然而,完整的多波段集可能會(huì )導致交叉干擾(cross talk / bleed through,即其中一個(gè)通道的發(fā)射通過(guò)另一個(gè)通道的二色鏡和發(fā)射光濾光片傳輸)的對比度降低。通過(guò)在被稱(chēng)為 Pinkel 和 Sedat 的配置中組合單波段和多波段濾光片,研究人員能夠有效減少滲透。

  Pinkel 濾光片——這種配置使用帶有多波段二色鏡和多波段發(fā)射光濾光片的單波段激發(fā)光濾光片。通過(guò)利用 LED 照明系統的獨立通道切換(如 CoolLED pE-800 系列),其中單波段濾光片被安裝于照明系統中(每個(gè) LED 的前面),可以在 <7 μs 的速度下進(jìn)行順序成像。然而,由于熒光團發(fā)射的廣譜特性,在某些實(shí)驗中,多波段發(fā)射光濾光片仍可能存在一些交叉干擾和對比度降低的風(fēng)險 熒光團發(fā)射的性質(zhì)

  Sedat 濾光片——為避免交叉干擾,Sedat 濾光片配置使用與 Pinkel 類(lèi)似的設置,但也使用單波段發(fā)射光濾光片。為了避免使用發(fā)射光濾光輪(emission filter wheels)(因為移動(dòng)會(huì )引入延遲并限制成像速度),一個(gè)聰明的技巧是:將圖像分離器合并到發(fā)射光路中。它們將發(fā)射光路分成最多四個(gè)圖像,并顯示在相機芯片的不同區域(或不同的相機),并容納位于光路中的單波段發(fā)射光濾光片。這種設置結合了 Sedat 濾光片組的高對比度和 <7 μs LED 開(kāi)關(guān)速度。

  有關(guān)濾光片的重要提示

  升級照明系統時(shí),請檢查您的濾光片:此前,濾光片是圍繞汞和金屬鹵化物燈的輻照度峰值設計的。當與 LED 照明系統一起使用時(shí),激發(fā)光濾光片的不良匹配會(huì )降低激發(fā)光輻照度,從而降低信號——這可能會(huì )影響圖像質(zhì)量并進(jìn)一步影響數據的解釋。若實(shí)驗室升級光源,您需要重新考慮您的濾光片。實(shí)驗室現在可以使用與 LED 兼容的濾光片,來(lái)匹配 LED 和流行熒光團的光譜。

  LED 與激光(laser)不同:與激光相比,每個(gè) LED 都具有更廣的光譜,且可以使用濾光片定制以激發(fā)更廣泛的熒光團。例如,若與適當的激發(fā)光濾光片一起使用,CoolLED pE-300 系列的藍色 LED 可以激發(fā) CFP、GFP 或 Ch2。

  利用單個(gè) LED 增強對比度:沒(méi)有濾光片可以完全阻擋不需要的光。因此,與使用具有單獨通道控制的 LED 照明技術(shù)相比,白光照明將導致更高的背景(因此對比度也更低)。

  LED 需要激發(fā)光濾光片:即使僅使用相應的 LED 來(lái)激發(fā)熒光團, 每個(gè) LED 光譜也都會(huì )有一個(gè)“尾巴”,如果不使用激發(fā)光濾光片來(lái)阻擋,它會(huì )導致背景噪聲(如圖 2所示)。

  若您有特定的濾光片要求:濾光片制造商不會(huì )在其網(wǎng)站上列出所有濾光片,若您聯(lián)系他們詢(xún)問(wèn),他們很可能會(huì )為您提供適合您定制需求的濾光片。

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